本发明涉及植物生物技术领域,具体涉及一种包含有水稻抗病相关基因Os2H16的DNA片段的分离克隆方法和及其功能验证和应用,具体利用强启动子驱动和基于RNA干扰(RNA interference,RNAi)原理的转基因技术,将Os2H16基因的超量表达载体和RNAi载体转入水稻品种中花11,超量及抑制水稻中Os2H16基因的表达。Os2H16基因表达量显著提高的遗传转化水稻对白叶枯病菌的抗性明显增强,表达量显著降低的遗传转化水稻对白叶枯病菌的抗性明显减弱,证明Os2H16基因在水稻抗白叶枯病中发挥重要作用。
1.超量表达如SEQxa0IDxa0NO.1所示的水稻抗病相关基因Os2H16在增加水稻对白叶枯病抗性中的应用。技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域,提供了一个水稻抗病相关基因Os2H16的分离克隆和功能验证,Os2H16基因表达量显著提高的遗传转化水稻对白叶枯病菌的抗性明显增强。
背景技术
植物在生长的过程中,受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多,包括病毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果:(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖,引起相关病症;(2)寄主植物产生抗病反应,杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性,是预防病害同时又保护环境的根本出路。植物的抗病反应是多基因参与调控的复杂过程。参与植物抗病反应的基因分为两类:(1)抗病基因,又称R(resistance)基因和(2)抗病相关基因。根据目前人们对抗病基因功能的认识,这类基因的产物主要是作为受体,直接或间接与病原蛋白相互作用,启动植物体内的抗病信号传导路径(Tang等,1996,Sciencexa0274:2060-2063;Baker等,1997,Sciencexa0276:726-733;Jia等,2000,EMBOxa0J.19:4004-4014;Dangl和Jones,2001,Naturexa0411:826-833;Nimchuk等,2001,Curr.Opin.Plantxa0Biol.4:288-294)。抗病基因介导的抗病反应强,是很好的基因资源。但由于下述原因,使利用抗病基因改良植物抗性受到限制:(1)抗病基因的资源有限,如目前知道的抵抗水稻重要病害白叶枯病的抗病基因少于30个,抵抗另一水稻重要病害-稻瘟病的抗病基因也只有大约40个;(2)抗病基因具有病原种类和病原生理小种特异性,抗病范围有限;(3)因为病原的快速突变,一个抗病基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。抗病相关基因是指除抗病基因外所有参与抗病反应的基因,它们的编码产物参与合成植物体内抗病信号分子、参与信号传导或参与防卫反应等。这类基因的共同特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少,因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差异大规模地鉴定植物抗病相关基因(Maleck等,2000,Naturexa0Genet.26:403-410;Schenk等,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USAxa097:11655-11660;Zhou等,2002,Sciencexa0inxa0Chinaxa045:449-467)。目前,人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道,绝大多数抗病相关基因单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小。但根据下述原因,它们是值得大力开发的基因资源:(1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用,这类基因是具有持久抗性的基因资源;(2)大多数抗病相关基因参与的抗病反应没有病原特异性,因此它们是具有广谱抗性的基因资源;(3)这类基因的资源丰富。植物的抗病反应可以分为两大类。长期以来研究者们对这两大类抗病反应给予了不同名称,如垂直抗性和水平抗性(Vanxa0Derxa0Plank等,1968,Diseasexa0Resistancexa0inxa0Plants,Academic,Newxa0York)、质量抗性和数量抗性(Ou等,1975,Phytopathologyxa065:1315-1316)、完全抗性和部分抗性(Parlevliet,1979,Annu.Rev.Phytopathol.1:203-222)。质量抗性(或垂直抗性或完全抗性)是抗病基因介导的抗病反应。数量抗性(或水平抗性或部分抗性)是由数量性状位点(quantitativexa0traitxa0locus,QTL)调控的抗病反应,它被认为无病原特异性,而且抗性持久(Roumen,1994,Ricexa0Blastxa0Disease,Zeigler等编著,CABxa0International,Cambridge,UK,pp.245-265)。目前,人们对植物抗病QTL的基因本质还不清楚。因此,虽然水稻中已经鉴定出了大量抗病QTL,如抗白叶枯病QTL(Li等,1999,Mol.Gen.Genet.261:58-63)、抗稻瘟病QTL(Wang等,1994,Geneticsxa0136:1421-1434;Chen等,2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USAxa0100:2544-2549)、抗纹枯病QTL(Li等,1995,Theor.Appl.Genet.91:382-388)和抗病毒病QTL(Albar等,1998,Theor.Appl.Genet.97:1145-1154)等,但这些抗性QTL没有被很好地用于水稻品种抗病性的改良。近年研究发现很多抗病相关基因的染色体位置与抗病QTL相对应,提示这些抗病相关基因可能就是相对应的QTL。抗病相关基因的染色体位置与抗病QTL相对应这一现象在多种植物中都被观察到,包括水稻(Xiong等,2002,中国科学45:518-526;Ramalingam等,2003,Mol.Plant-Microbexa0Interact.16:14-24;Wen等,2003,Mol.Gen.Genomicsxa0269:331-339;Chu等,2004,Mol.Gen.Genomicsxa0271:111-120)、小麦(Faris等,1999,Theor.Appl.Genet.98:219-225)、豆类(Geffroy等,2000,Mol.Plant-Microbexa0Interact.13:287-296)和马铃薯(Trognitz等,2002,Mol.Plant-Microbexa0Interact.15:587-597)。这些结果为采用候选基因策略分离、克隆和利用抗病QTL的基因提供了依据。水稻是世界上重要的粮食作物,但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。因此,了解病害的发病机制,有助于利用高效途径改良水稻品种的抗性,控制病害的发生,减少或避免植物病害所带来的损失。分离克隆抗病相关基因是对水稻抗病机理研究的前提。同时,与抗病基因的应用相比,抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过超量表达抗病相关基因进行水稻品种的改良,将进一步增强植物的抗病性,拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。因此如何利用水稻抗病基因的克隆获得抗病植株成为亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明的发明人针对上述现有技术的情况,提供了一个从水稻中分离克隆出的抗病相关基因完整编码区段的DNA片段,利用这个基因改良水稻或其它植物抵御病害的能力,这个基因被命名为Os2H16,其基因的序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.1所示,或者基本上相当于SEQxa0IDxa0NO.1所示的DNA序列,或者其功能相当于SEQxa0IDxa0NO.1所示序列的亚片段。该基因片段Os2H16表达量显著提高的遗传转化水稻对白叶枯病菌的抗性明显增强,可见采用超量表达之后可以赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonasxa0oryzaexa0pv.oryzae)所引起的病害产生抗病反应,获得高抗病植株。发明人首先提供了一个从水稻中分离克隆出的抗病相关基因完整编码区段的DNA片段,并命名为Os2H16,其基因的序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.1所示,或者基本上相当于SEQxa0IDxa0NO.1所示的DNA序列,或者其功能相当于SEQxa0IDxa0NO.1所示序列的亚片段,其编码的氨基酸序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.2所示。获得了这一片段之后,将这一序列与合适的载体连接,可以转入植物细胞,产生转基因植物,发现Os2H16基因表达量显著提高的遗传转化水稻对白叶枯病菌的抗性明显增强,表达量显著降低的遗传转化水稻对白叶枯病菌的抗性明显减弱,证明Os2H16基因在水稻抗白叶枯病中发挥重要作用,因此证实了超量表达该基因后可以赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonasxa0oryzaexa0pv.oryzae)所引起的病害产生抗病反应,获得高抗病植株。该基因片段来源于水稻IRBB13(Oryzaxa0sativa,)其通过特殊设计的引物扩增水稻IRBB13基因组DNA获得,其中所述的引物包括引物1,5′-ACGCCAGCACAGTCGCAGTA-3′其序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.3所示,引物2,5′-TGGAACCCCGAGGAAAGAAC-3′其序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.4所示,之后利用强启动子驱动和基于RNA干扰(RNAxa0interference,RNAi)原理的转基因技术,将Os2H16基因的超量表达载体和RNAi载体转入水稻品种中花11,超量及抑制水稻中Os2H16基因的表达。Os2H16基因表达量显著提高的遗传转化水稻对白叶枯病菌的抗性明显增强,表达量显著降低的遗传转化水稻对白叶枯病菌的抗性明显减弱,证明Os2H16基因在水稻抗白叶枯病中发挥重要作用。采用之所以采用上述的方法,主要是由于将克隆的抗病相关基因转入感病的植物,有助于产生新的抗病植物。特别是可以用遗传转化技术在植物中累加多个抗性基因,而不会产生传统育种技术中伴随出现的连锁基因组序列。而抗病相关基因的克隆是克服传统育种不能植物种间转移抗病相关基因问题的前提。综上所述,本发明的发明人在国际上首次提供了一个从水稻中分离克隆出的抗病相关基因完整编码区段的DNA片段,并命名为Os2H16,并验证了该基因的功能,利用其功能最终发现采用超量表达之后可以赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonasxa0oryzaexa0pv.oryzae)所引起的病害产生抗病反应,获得高抗病植株。
附图说明
图1.用定量RT-PCR技术检测IRBB13接种白叶枯病菌PXO99后Os2H16基因的表达模式结果示意图;图中黑色柱形图表示接种H₂O后基因的表达,白色的柱形图表示的是接种PXO99后基因的表达,可以看到在接种0、12、48、72h后取样的检测结果,以接种水为对照,可见在接种72h后,Os2H16基因表达与对照相比有明显的提高;图2.Os2H16基因的结构及用于超量表达和抑制表达遗传转化载体构建的DNA片段长度和结构示意图;图中线条表示内含子;柱条表示外显子(编码序列);数字表示各个结构的碱基数;长箭头代表超量表达遗传转化水稻DNA片段的长度(1089bp)和相对应基因结构的位置;“ATG”和“TGA”分别是翻译起始密码和终止密码;图3.为遗传转化载体pU1301的结构示意图;图4.为遗传转化载体ds1301RNAi机制示意图;图5.超量表达和抑制表达T₀代遗传转化植株接种白叶枯病菌PXO99两周后结果示意图;图中,超量表达T₀代遗传转化植株(CD20ZH-1、CD20ZH-4、CD20ZH-5)接种白叶枯病菌PXO99两周后形成的病斑明显比感病水稻品种中花11(对照)的短;抑制表达T₀代遗传转化植株(CD21ZH-1、CD21ZH-2、CD21ZH-4)接种白叶枯病菌PXO99两周后形成的病斑明显比感病水稻品种中花11(对照)的长;中花11为遗传转化受体材料;图6.用定量RT-PCR技术检测超量表达遗传转化水稻中Os2H16基因在对照材料中花11和T₀代遗传转化植株中的表达量结果示意图;图中纵坐标为Os2H16基因在每份水稻材料中的相对表达量(对照材料的表达量定为1);图7.用定量RT-PCR技术检测抑制表达遗传转化水稻中Os2H16基因在对照材料中花11和T₀代遗传转化植株中的表达量结果示意图;图中纵坐标为Os2H16基因在每份水稻材料中的相对表达量(对照材料的表达量定为1);图8为图5的彩色示意图。
具体实施方式
以下实施例中进一步定义本发明,根据以上的描述和这些实施例,本领域技术人员可以确定本发明的基本特征,并且在不偏离本发明精神和范围的情况下,可以对本发明作出各种改变和修改,以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外,本发明所采用的均为本领域现有技术;实施例1:分离克隆Os2H16基因和基因结构分析11..从水稻品种IRBB13中分离克隆Os2H16基因由于水稻IRBB13的基因组是没有被测序的,因此发明人根据核苷酸数据库GenBankxa0AP005968中的同源基因序列设计引物(引物1,5′-ACGCCAGCACAGTCGCAGTA-3′其序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.3所示,引物2,5′-TGGAACCCCGAGGAAAGAAC-3′其序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.4所示)用来获得Os2H16基因。提取水稻IRBB13基因组DNA,作为模板,进行PCR扩增,反应程序如下:预变性94°C5min,变性94°C40s,退火54°C40s,延伸72°C1.5min,反应35个循环,后延伸72°Cxa07min,结束后,用康为公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增片段,然后将纯化的DNA片段连接至载体pGEM-T中(Promega公司),转化E.colixa0DH5ɑ感受态细胞,挑选阳性克隆提质粒,测序由华大基因完成。结果以水稻IRBB13基因组DNA为模板,经过PCR扩增后,获得一个长度为1089bp的DNA片段,具有序列表SEQxa0IDxa0NO.1的DNA序列。与AP005968序列进行比较,没有碱基突变和缺失,因此不会影响到基因的功能改变。2..Os2H16基因内含子的确定为了确定Os2H16基因的内含子,本发明根据基因测序结果与cDNA序列(GenBankxa0Accessionxa0NO.AK058338)比较,最终确定在序列表SEQxa0IDxa0NO.1所示序列的164至887bp序列中存在一个724bp的内含子(如图2所示)。3..Os2H16基因产物的结构分析根据BLAST分析结果,Os2H16基因中,第61-163位和第888-1030位碱基为编码基因,编码的蛋白质由81个氨基酸组成,其氨基酸序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.2所示,没有保守结构域,是一个功能未知的蛋白。实施例2:Os2H16基因在水稻品种中的表达模式分析为了证实Os2H16基因参与抗病反应的调控,我们采用定量RT-PCR技术分析了Os2H16基因在白叶枯病菌PXO99诱导后的表达模式。白叶枯病菌接种采用剪叶法(Kauffman等,1973,Anxa0improvedxa0techniquexa0forxa0evaluatingxa0resistancexa0ofxa0ricexa0varietiesxa0toxa0Xanthomonasxa0oryzae,Plantxa0Dis.Rep.57,537-541)对成株期的水稻进行接种。定量RT-PCR技术中的Os2H16基因特异PCR引物是引物3,5′-CAGTGGCGAGGCGAGTAAG-3′其序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.5所示和引物4,5′-GTGTTTGGGCTTGGTGTTTATG-3′其序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.6所示。分析结果显示白叶枯病菌接种后可以诱导增强Os2H16基因的表达(图1),说明Os2H16基因参与抗白叶枯病反应的调控。实施例3:Os2H16基因的功能验证和应用本发明所用载体是pU1301。pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(Sun等,2004,Xa26,axa0genexa0conferringxa0resistancexa0toxa0Xanthomonasxa0oryzaexa0pv.oryzaexa0inxa0rice,encodingxa0axa0LRRxa0receptorxa0kinase-likexa0protein.Plantxa0Journal.37:517-527)基础上改建的,携带玉米泛素组成型、超量表达启动子的农杆菌介导的遗传转化载体(如图3所示)。以水稻IRBB13DNA为模板,用正向引物-引物5(5′-ATGGGTACCACGCCAGCACAGTCGCAGTA-3′,带下划线碱基为限制性内切酶KpnI识别位点,其序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.7所示)和反向引物-引物6(5′-ATGGGATCCTGGAACCCCGAGGAAAGAAC-3′,带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点,其序列如序列表SEQIDNO.8所示)扩增基因片段,PCR反应程序如下:预变性94°C5min,变性94°C40s,退火63°C40s,延伸72°C1.5min,反应35个循环,后延伸72°C7min,获得SEQxa0IDxa0NO.1的片段,PCR产物用KpnI和BamHI进行酶切,同时用KpnI和BamHI酶切携带玉米泛素启动子的遗传转化载体pU1301,酶切完毕,纯化酶切产物。用Os2H16基因的酶切片段和载体做连接反应,通过酶切筛选阳性克隆;命名为pU1301::Os2H16,用于超量表达使用。同时,本发明采用RNA干扰(RNAxa0interference,RNAi)技术,通过抑制水稻品种中花11中Os2H16基因的表达,验证该基因的功能。这个技术途径的主要机理:将目标基因的部分片段以反向重复的形式与能够表达双链RNA(doublexa0strandxa0RNA,dsRNA)的载体连接,通过遗传转化将该载体导入植物中。获得的转化植株大量表达与目标基因部分片段同源的dsRNA。这些dsRNA迅速形成短干扰RNA(shortxa0interferingxa0RNA,siRNA)。这些siRNA与目标基因的转录子(mRNA)互补配对,在细胞内特殊酶的作用下使目标基因的转录子降解,从而在mRNA水平上抑制目标基因的功能。研究者可以通过转基因植株表型的改变,验证目标基因的功能。RNA干扰技术已被广泛用于基因功能的验证(Smith等,2000,Nature407:319-320)。本发明用引物7(5′-AAGACTAGTGGTACCAGCTCGCTGATGCCAGTGG-3′,带下划线碱基为限制性内切酶SpeI和KpnI识别位点,其序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.9所示)和引物8(5′-AAGGAGCTCGGATCCTCATGGGTGAGAGTGGCCAT-3′,带下划线碱基为限制性内切酶SacI和BamHI识别位点,其序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.10所示),Os2H16基因cDNA片段为模板,PCR扩增待转化的DNA片段,PCR反应程序如下:预变性94°C5min,变性94°C40s,退火65°C40s,延伸72°C30s,反应35个循环,后延伸72°C7min。构建Os2H16基因片段的第一重复链(正向链):用KpnI和BamHI消化部分PCR产物及载体ds1301(如图4所示),消化完全后在75°C水浴10min灭活限制性内切酶,置于冰上,用T4DNA连接酶进行连接反应。热激后获得的克隆质粒用引物7和8扩增筛选阳性克隆。构建Os2H16基因片段的第二重复链(反向链):用SpeI和SacI消化剩余的PCR产物和上述筛选出的连接了第一重复链的阳性克隆质粒,消化完全后再75°C水浴10min灭活限制性内切酶,置于冰上,用T4DNA连接酶进行连接反应。热激后获得的克隆质粒用SacI和SpeI双酶切消化反应筛选阳性克隆,命名为ds1301::Os2H16,作为抑制表达载体。将构建好的超量和抑制表达载体pU1301::Os2H16和ds1301::Os2H16电转化农杆菌感受态细胞EHA105,保存菌株用作农杆菌介导的水稻遗传转化。采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang,Optimisingxa0thexa0tissuexa0culturexa0conditionsxa0forxa0highxa0efficiencyxa0transformationxa0ofxa0indicaxa0rice,2005,Plantxa0Cellxa0Rep.23:540-547)将超量和抑制表达载体导入感病水稻品种中花11。获得的遗传转化植株分别被命名为CD20ZH和CD21ZH。本发明共分别获得独立转化植株21和24株,对转基因植株进行阳性鉴定后,分别对9株超量植株,命名为CD20ZH和10株抑制植株,命名为CD21ZH,在成株期阶段接种白叶枯病菌PXO99,发现超量植株抗性有不同程度的增强,抑制植株抗性有不同程度的减弱;与转基因的受体水稻品种中花11相比,抗性增强的转化植株的病斑长度缩短了2.87cm-5.1cm,抗性减弱的转化植株的病斑长度变长了1.73cm-7.33cm(表1)(如图5所示)。表1.部分T₀代转化植株对白叶枯病菌PXO99的反应ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>为进一步验证转化植株的抗病能力是否与Os2H16基因的表达量相关,本发明分别从表1中所列转化植株中选取3个株系的超量和抑制植株,抽提总RNA,利用iQ^TM5定量PCR仪(Bio-Rad公司)、SYBRxa0Green荧光嵌入染料做定量RT-PCR分析,比较转化植株和对照材料中Os2H16基因表达量。PCR反应引物是2H16F(5′-CAGTGGCGAGGCCAGTAAG-3′,其序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.11所示)和2H16R(5′-GTGTTTGGGCTTGGTGTTTATG-3′,其序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.12所示)。以水稻肌动蛋白的RT-PCR产物作为样品量一致性对照。肌动蛋白PCR引物序列是actinF(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3′其序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.13所示)和actinR(5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3′,其序列如序列表SEQxa0IDxa0NO.14所示)。实验结果显示Os2H16基因的表达量与植株的抗性密切相关(图6和7)。抗病性增强的转化植株中Os2H16基因的表达量与对照材料中花11相比显著增加,抗病性减弱的转化植株中Os2H16基因的表达量与对照材料中花11相比显著减少。该结果说明了Os2H16基因的编码产物在水稻抗白叶枯病反应发挥正调控因子的作用。可见采用超量表达之后可以赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonasxa0oryzaepv.oryzae)所引起的病害产生抗病反应,获得高抗病植株。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="455"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="456"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="448"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>